Mit HPLC dem Virus auf der Spur
27 Jan 2022
Noch nie zuvor war das Thema präsenter als heute – Die Bestimmung von Viren und deren Mutationen ist mitunter überlebenswichtig. Jedes Jahr muss aufs Neue das dominante Grippevirus mit seinen spezifischen Eigenschaften bestimmt werden, um passenden Impfstoff herstellen zu können. Zur Bestimmung und Analyse der Viren kommt meistens die HPLC-Methode zum Einsatz. Damit diese jedoch gelingt, ist ein Lösungsmittel extrem wichtig: Qualitativ hochwertigstes Reinstwasser.
Ein Virus besteht typischerweise aus einem Nukleinsäuremolekül in einer Proteinhülle und kann sich nur in den lebenden Zellen eines Wirts vermehren. Viren werden oft fälschlicherweise als „lebendig“ bezeichnet, obwohl der korrekte Begriff „aktiv“ lautet. Es handelt sich um Parasiten, die in ihrer „aktiven“ Form außerhalb ihres Wirtsorganismus nicht lange überleben können und viel kleiner als Bakterien sind. Mit einem Durchmesser von 220 nm ist das Masernvirus zum Beispiel etwa 8-mal kleiner als E. coli Bakterien. Die Familie der Coronaviren ist mit einem durchschnittlichen Durchmesser von etwa 120 nm sogar noch kleiner.
Die HPLC- und LC/MS-Methoden sind unter anderem deshalb so nützlich für die Charakterisierung von Viren, weil sie die Züchtung spezifischer Antikörper und die Entwicklung von ELISA-Tests überflüssig machen: Die viralen Proteine oder Teile davon werden einfach auf einer HPLC-Säule separiert und anschließend direkt analysiert oder nach einer Massenspektrometrie.
HPLC kann daher als eine Schlüsselmethode bei der Untersuchung von Krankheitsausbrüchen angesehen werden. Sie ermöglicht durch die Charakterisierung der vorkommenden Spezies und deren Unterarten die Erstellung detaillierter epidemiologischer Karten. Solche Karten werden kontinuierlich erstellt, um Krankheiten wie die Grippe auf der ganzen Welt zu verfolgen.
Häufig arbeitet die HPLC an der Grenze der Detektion von Protein- oder Peptidmengen, die dann auf die Quantifizierung der Viruslast und die Charakterisierung des spezifischen Virustyps extrapoliert werden kann. Es ist daher zwingend erforderlich, dass die Lösungsmittel, die bei der Vorbereitung der Proben und für die Chromatographiezyklen selbst verwendet werden, so rein wie möglich sind. – Diese Anforderung muss auch das Wasser erfüllen, das während des gesamten Arbeitsablaufs verwendet wird.
Wie HPLC bei der Herstellung viraler Vektoren eingesetzt wird
Keine Geschichte der viralen Impfstoffentwicklung wäre vollständig, ohne Edward Jenner zu würdigen, der 1796 einen 13-jährigen Jungen mit dem Vaccinavirus (Kuhpocken) impfte und eine Immunität demonstrierte. Damit gilt er als der Begründer der Vakzinologie und setzte Standards, die noch bis weit hinein in das 20. Jahrhundert die Ausgangsbasis für die Impfstoffforschung bleiben sollten.
Als sich in den letzten Dekaden des 20. Jahrhunderts die Molekularbiologie entwickelte, begannen Wissenschaftler das Verhalten von Viren genauer zu studieren. Sie entdeckten, wie virale Partikel die genetische Maschinerie der menschlichen Zelle entern und verändern, und untersuchten daraufhin die Möglichkeit, diesen Prozess zur Entwicklung neuartiger Impfstoffe zu nutzen. Was wäre, wenn sie spezifische Viruspartikel so abschwächen und sie als Mittel verwenden könnten, um rekombinante Nukleinsäuren in den menschlichen Körper einzuführen? Was wäre, wenn sie dadurch den Körper dazu bringen könnten, die den Nukleinsäuren entsprechenden Proteine selber herzustellen und so eine Immunantwort hervorzurufen, um gegen Viruskrankheiten zu immunisieren? Virale Vektoren wurden zu einem Schlüssel der Impfstoffforschung.
Mit viralen Vektoren im Kampf gegen SARS-CoV-2 / COVID-19
Da sie sowohl humorale als auch zellvermittelte Immunantworten effektiv einleiten können, sind virale Vektoren eine großartige Alternative, um Impfstoffantigene für bestimmte Krankheiten zu liefern und sogar Krebszellen gezielt anzugreifen und abzutöten. Die Vorteile, die sich aus der erfolgreichen Anwendung viraler Vektoren mit rekombinanter DNA zur Vorbeugung und Behandlung menschlicher Krankheiten ergeben, sind potenziell enorm. Tatsächlich ist dies auch der Ansatz bei der Entwicklung des Impfstoffes der Universität Oxford / AstraZeneca gewesen, der gegen das neueste Coronavirus, SARS-CoV-2 oder COVID-19, weltweit verwendet wird. Eine Schlüsselrolle spielen dabei Adenoviren, die als Träger (Vektor) dienen. Andere Impfstoffe setzen dagegen auf RNA-Moleküle in Lipid-Nanopartikeln.
Adenoviren sind weit verbreitete Erkältungsviren und werden daher vom Immunsystem fast aller Menschen schnell erkannt. Gleichzeitig sind sie äußerst robust, was sie mit Blick auf die Lagerung und den Transport als Impfstoff auf der ganzen Welt attraktiv macht. Darüber hinaus ist der Einsatz von Adenoviralen Vektoren auch besonders sicher, da ihre DNA als nicht integrierend gilt und somit ihr Erbgut nicht ins Zellgenom des Menschen eindringen kann.
HPLC und LC/MS werden nicht nur zur Charakterisierung der notwendigen rekombinanten Proteine verwendet, die von viralen Vektoren produziert werden. Neben der Gel- oder PCR-basierten Methode zählen HPLC und LC/MS zu den wichtigsten Methoden, die zur Quantifizierung und Qualitätskontrolle im gesamten Prozess der Impfstoffherstellung eingesetzt werden. Die an der Aufbereitung von Adenoviren beteiligten Schritte sind:
(1) Zelllyse und Abbau der genomischen DNA,
(2) Klärung
(3) Konzentration mit Ultrafiltration/Diafiltration,
(4) Anionenaustausch-Reinigung,
(5) Gelfiltration und
( 6) Mikrofiltration.
HPLC kann für die Qualitätskontrolle einer oder aller dieser Stufen verwendet werden. Sie ist besonders wichtig, um sicherzustellen, dass alle Verunreinigungen entfernt werden - insbesondere am Ende des Prozesses, wo sie an der Nachweisgrenze arbeitet.
Fazit
Die Bedeutung hochwertiger HPLC- und LC/MS-Assays in unserem Kampf gegen Viren und Krankheiten kann nicht unterschätzt werden - sei es bei der Charakterisierung des Virus an erster Stelle oder bei der Überwachung der Produktion von Impfstoffen, die auf potenzielle Heilung ausgerichtet sind. Dabei arbeitet HPLC häufig an den unteren Extremwerten der Erkennung. Es muss deshalb sichergestellt werden, dass in allen Phasen dieser extrem sensiblen Forschung und Herstellung, qualitativ hochwertiges Reinstwasser verwendet wird. Dafür sorgen Reinstwasseranlagen von ELGA Labwater. Wenn Sie mehr darüber erfahren möchten, laden Sie unser White Paper herunter:
